D'Alzheimer Krankheet (AD) feelt Protein Biomarker déi seng multiple Basisdaten Pathologie reflektéieren, wat de Fortschrëtt vun der Diagnostik a Behandlung behënnert. Hei benotze mir ëmfaassend Proteomik fir zerebrospinal Flëssegkeet (CSF) Biomarker z'identifizéieren déi eng breet Palette vun AD Pathophysiologie representéieren. Multiplex Massespektrometrie identifizéiert ongeféier 3.500 an ongeféier 12.000 Proteinen an AD CSF respektiv am Gehir. D'Netzanalyse vum Gehirnproteom huet 44 Biodiversitéitsmoduler opgeléist, 15 vun deenen iwwerlappt mam Cerebrospinal Fluid Proteome. D'CSF AD Marker an dësen iwwerlappende Moduler ginn a fënnef Proteingruppen geklappt, déi verschidde pathophysiologesch Prozesser representéieren. D'Synapsen an d'Metaboliten am AD Gehir erofgoen, awer d'CSF eropgeet, während déi glialräich Myelinatioun an Immungruppen am Gehir an CSF eropgoen. D'Konsistenz an d'Krankheet Spezifizitéit vun de Panel Ännerungen goufen a méi wéi 500 zousätzlech CSF Proben bestätegt. Dës Gruppen hunn och biologesch Ënnergruppen an asymptomatescher AD identifizéiert. Insgesamt sinn dës Resultater e verspriechende Schrëtt a Richtung Web-baséiert Biomarker Tools fir klinesch Uwendungen an AD.
Alzheimer Krankheet (AD) ass déi heefegst Ursaach vun neurodegenerativen Demenz weltwäit a charakteriséiert sech duerch eng breet Palette vu biologesche System Dysfunktiounen, dorënner synaptesch Iwwerdroung, glial-mediéiert Immunitéit, a mitochondriale Metabolismus (1-3). Wéi och ëmmer, seng etabléiert Protein Biomarker konzentréieren sech nach ëmmer op Amyloid an Tau Protein z'entdecken, an dofir kënnen dës divers Pathophysiologie net reflektéieren. Dës "Kär" Protein Biomarker, déi am meeschte zouverlässeg a cerebrospinal Flëssegkeet (CSF) gemooss ginn, enthalen (i) Amyloid Beta Peptid 1-42 (Aβ1-42), wat d'Bildung vu kortikale Amyloid Plaques reflektéiert; (ii) total tau, en Zeechen vun Axon Degeneratioun; (iii) Phospho-tau (p-tau), e Vertrieder vun der pathologescher Tau-Hyperphosphorylatioun (4-7). Och wann dës cerebrospinal Flëssegkeet Biomarker eis Detektioun vu "markéierten" AD Protein Krankheeten (4-7) immens erliichtert hunn, representéieren se nëmmen e klengen Deel vun der komplexer Biologie hannert der Krankheet.
De Mangel u pathophysiologescher Diversitéit vun AD Biomarker huet zu villen Erausfuerderunge gefouert, dorënner (i) d'Onméiglechkeet fir d'biologesch Heterogenitéit vun AD Patienten z'identifizéieren an ze quantifizéieren, (ii) net genuch Messung vun der Krankheet Gravitéit a Progressioun, besonnesch an der preklinescher Etapp, An ( iii) d'Entwécklung vun therapeuteschen Drogen, déi net all Aspekter vun der neurologescher Verschlechterung komplett léisen. Eis Ofhängegkeet op Landmark Pathologie fir AD vu verwandte Krankheeten ze beschreiwen, verschäerft nëmmen dës Problemer. Méi a méi Beweiser weisen datt déi meescht eeler Leit mat Demenz méi wéi eng pathologesch Charakteristik vu kognitiven Réckgang hunn (8). Sou vill wéi 90% oder méi vun Individuen mat AD Pathologie hunn och vaskulär Krankheet, TDP-43 Inklusiounen oder aner degenerativ Krankheeten (9). Dës héich Undeeler vu pathologescher Iwwerlappung hunn eisen aktuellen diagnostesche Kader fir Demenz gestéiert, an eng méi ëmfaassend pathophysiologesch Definitioun vun der Krankheet ass néideg.
Am Hibléck op den dréngende Bedierfnes fir eng Vielfalt vun AD Biomarker, adoptéiert d'Feld ëmmer méi d'"Omics" Method baséiert op dem Gesamtsystem fir Biomarker z'entdecken. D'Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance gouf am 2014 gestart an ass un der Spëtzt vum Programm. Dëse multidisziplinären Effort vun den Nationalen Instituter fir Gesondheet, Akademie an Industrie zielt fir systembaséiert Strategien ze benotzen fir d'Pathophysiologie vun der AD besser ze definéieren an d'Biodiversitéit diagnostesch Analyse a Behandlungsstrategien z'entwéckelen (10). Als Deel vun dësem Projet ass Netzwierkproteomik e verspriechend Tool fir de Fortschrëtt vu systembaséierte Biomarker an AD ginn. Dës onparteiesch Donnéeën ugedriwwen Approche organiséiert komplex proteomics Datesets a Gruppen oder "Module" vu co-expriméierte Proteinen, déi mat spezifeschen Zelltypen, Organellen a biologesche Funktiounen assoziéiert sinn (11-13). Bal 12 Informatiounsräich Netzwierkproteomikstudien goufen am AD Gehir gemaach (13-23). Insgesamt weisen dës Analysen datt den AD Gehirnetzproteom eng héich konservéiert modulär Organisatioun an onofhängege Kohorten a multiple kortikale Regiounen hält. Zousätzlech weisen e puer vun dëse Moduler reproduzéierbar Ännerungen am AD-bezunnen Heefegkeet iwwer Datesets, déi d'Pathophysiologie vu verschidde Krankheeten reflektéieren. Zesummen beweisen dës Erkenntnisser e verspriechende Verankerungspunkt fir d'Entdeckung vum Gehirnetzproteom als e systembaséierte Biomarker an der AD.
Fir den AD Gehirnetzproteom an klinesch nëtzlech systembaséiert Biomarker ze transforméieren, hu mir de Gehir-ofgeleet Netzwierk mat der proteomescher Analyse vun AD CSF kombinéiert. Dës integréiert Approche huet zu der Identifikatioun vu fënnef villverspriechend Sätze vu CSF Biomarker gefouert, déi mat enger breet Palette vu Gehir-baséierter Pathophysiologie verbonne sinn, dorënner Synapsen, Bluttgefässer, Myelinatioun, Entzündung an Dysfunktioun vu metabolesche Weeër. Mir hunn dës Biomarker Panelen erfollegräich duerch multiple Replikatiounsanalysen validéiert, dorënner méi wéi 500 CSF Proben aus verschiddenen neurodegenerativen Krankheeten. Dës Validatiounsanalyse beinhalt d'Untersuchung vun Gruppenziler an der CSF vu Patienten mat asymptomatescher AD (AsymAD) oder Beweiser fir anormal Amyloidakkumulatioun an engem normale kognitiven Ëmfeld ze weisen. Dës Analysen markéieren déi bedeitend biologesch Heterogenitéit an der AsymAD Bevëlkerung an identifizéieren Panelmarker déi fäeg sinn Individuen an de fréiste Stadien vun der Krankheet ze subtypéieren. Insgesamt representéieren dës Resultater e Schlëssel Schrëtt an der Entwécklung vu Protein Biomarker Tools baséiert op verschidde Systemer déi vill vun de klineschen Erausfuerderunge vun der AD mat Erfolleg léisen.
Den Haaptzweck vun dëser Etude ass nei zerebrospinal Flësseg Biomarker z'identifizéieren, déi verschidde Gehir-baséiert Pathophysiologie reflektéieren, déi zu AD féieren. Figur S1 skizzéiert eis Fuerschungsmethodologie, déi enthält (i) eng ëmfaassend Analyse gedriwwen duerch virleefeg Erkenntnisser vun AD CSF an dem Netzwierk Gehirproteom fir verschidde Gehir-relatéiert CSF Krankheet Biomarker z'identifizéieren, an (ii) spéider Replikatioun Dës Biomarker sinn a verschidden onofhängege cerebrospinal. Flësseg Kohorten. D'Entdeckungsorientéiert Fuerschung huet ugefaang mat der Analyse vum differentiellen Ausdrock vu CSF bei 20 kognitiv normalen Individuen an 20 AD Patienten am Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). D'Diagnostik vun der AD gëtt definéiert als eng bedeitend kognitiv Behënnerung an der Präsenz vu nidderegen Aβ1-42 an erhöhten Niveauen vum totalen Tau a p-tau an der cerebrospinal Flëssegkeet [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabelle S1A). D'Kontroll (mengen MoCA, 26,7 ± 2,2) haten normal Niveau vun CSF biomarkers.
Mënsch CSF ass geprägt duerch eng dynamesch Palette vun Protein Iwwerfloss, an deem Albumin an aner extrem reichend Proteinen d'Detektioun vu Proteinen vun Interessi verhënneren kann (24). Fir d'Tiefe vun der Proteinentdeckung ze erhéijen, hu mir déi éischt 14 héich reichend Proteinen aus all CSF Probe virun der Massspektrometrie (MS) Analyse (24) geläscht. Insgesamt 39.805 Peptiden goufen duerch MS identifizéiert, déi op 3691 Proteome a 40 Proben gekaart goufen. Proteinquantifikatioun gëtt duerch Multiple Tandem Mass Tag (TMT) Etikettéierung gemaach (18, 25). Fir déi vermësst Donnéeën ze léisen, hu mir nëmmen déi Proteinen abegraff, déi an op d'mannst 50% vun de Proben an der spéider Analyse quantifizéiert goufen, also endlech 2875 Proteome quantifizéieren. Wéinst dem groussen Ënnerscheed am Ganzen Protein Heefegkeet Niveauen, war eng Kontroll Echantillon statistesch considéréiert en outlier (13) a war net an der spéider Analyse abegraff. D'Heefegkeet Wäerter vun de reschtlechen 39 Echantillon goufen no Alter, Geschlecht, a Batch Kovarianz ugepasst (13-15, 17, 18, 20, 26).
Mat statisteschen T-Test Analyse fir differenziell Ausdrock op der Regressiounsdatenset ze evaluéieren, identifizéiert dës Analyse Proteinen deenen hir Heefegkeetsniveauen wesentlech geännert goufen (P <0.05) tëscht der Kontroll an AD Fäll (Table S2A). Wéi an Dorënner 1A gewisen, war d'Heefegkeet vun am Ganzen 225 Proteinen an AD bedeitend reduzéiert, an d'Heefegkeet vun 303 Proteinen war bedeitend erhéicht. Dës differenziell ausgedréckte Proteine enthalen e puer virdru identifizéiert Cerebrospinal Flëssegkeet AD Marker, sou wéi Mikrotubule-assoziéiert Protein tau (MAPT; P = 3.52 × 10-8), Neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10-3), Wuesstumsbezunnen Protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), Fettsäurebindende Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), Chitinase 3 wéi 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), Neural Granulin (NRGN; P = 3,43 × 10-4) an VGF Nerve Wuesstem Faktor (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Allerdéngs identifizéiert mir och aner ganz wichteg Ziler, wéi PIB dissociation inhibitor 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) an SPARC-Zesummenhang modulare Kalzium bindend 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontologie (GO) Analyse vun 225 wesentlech reduzéiert Proteinen huet enk Verbindunge mat Kierperflëssegkeetsprozesser wéi Steroidmetabolismus, Bluttkoagulatioun an Hormonaktivitéit opgedeckt (Dorënner 1B an Table S2B). Am Géigesaz ass de wesentlech erhéicht Protein vun 303 enk mat der Zellstruktur an dem Energiemetabolismus verbonnen.
(A) De Vulkanplot weist d'log2-Faltverännerung (x-Achs) relativ zum -log10 statistesche P-Wäert (Y-Achs) kritt vum T-Test, dee benotzt gëtt fir differenziell Ausdrock tëscht der Kontroll (CT) an z'entdecken. AD Fäll vum CSF Proteome Vun alle Proteinen. Proteine mat wesentlech reduzéierten Niveauen (P <0.05) an AD ginn a blo ugewisen, während Proteine mat wesentlech erhéicht Niveauen an der Krankheet a rout gewise ginn. De gewielte Protein ass markéiert. (B) Déi Top GO Begrëffer am Zesummenhang mat Protein si wesentlech reduzéiert (blo) a erhéicht (rout) an AD. Weist déi dräi GO Begrëffer mat den héchsten z-Scores an de Beräicher vun biologesche Prozesser, molekulare Funktiounen, an Zell Komponente. (C) MS gemooss MAPT Niveau an CSF Prouf (lénks) a seng Korrelatioun mat Prouf ELISA tau Niveau (riets). De Pearson Korrelatiounskoeffizient mam relevante P Wäert gëtt ugewisen. Wéinst dem Mangel un ELISA Daten fir een AD Fall enthalen dës Zuelen Wäerter fir 38 vun den 39 analyséierte Fäll. (D) Iwwerwaacht Cluster Analyse (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) ugepasst P <0.01) op der Kontroll an AD CSF fonnt Echantillon mat der 65 bedeitendst geännert Proteinen am Datesaz benotzt. Standardiséieren, normaliséieren.
D'proteomic Niveau vun MAPT ass enk Zesummenhang mat der onofhängeg gemooss ELISA tau Niveau (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Dorënner 1C), d'Validitéit vun eiser MS Miessung ënnerstëtzen. No Trypsin Verdauung um Niveau vum Amyloid Virgängerprotein (APP), kënnen d'isoformspezifesch Peptiden, déi op den C-Terminus vun Aβ1-40 an Aβ1-42 kartéiert sinn, net effizient ioniséiert ginn (27, 28). Dofir hunn d'APP-Peptiden, déi mir identifizéiert hunn, näischt mat ELISA Aβ1-42 Niveauen ze dinn. Fir den differentiellen Ausdrock vun all Fall ze evaluéieren, benotzt mir differentiell ausgedréckt Proteinen mat P VerfÜgung & Si besteet; 0.0001 [falsch Entdeckung Taux (FDR) korrigéiert P VerfÜgung & Si besteet; 0.01] eng iwwerwaacht Stärekoup Analyse vun de Echantillon ze Leeschtunge (Table S2A). Wéi an Dorënner 1D gewisen, kënnen dës 65 héich bedeitendst Proteinen korrekt Echantillon no Krankheet Staat Cluster, ausser engem AD Fall mat Kontroll-wëll Charakteristiken. Vun dëse 65 Proteine sinn 63 an der AD eropgaang, während nëmmen zwee (CD74 an ISLR) erofgaange sinn. Am Ganzen hunn dës cerebrospinal Flëssegkeet Analysen Honnerte vu Proteinen an AD identifizéiert, déi als Krankheet Biomarker déngen kënnen.
Duerno hu mir eng onofhängeg Netzwierkanalyse vum AD Gehirproteom gemaach. D'Gehir Kohort vun dëser Entdeckung abegraff dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) aus Kontroll (n = 10), Parkinson d'Krankheet (PD; n = 10), gemëscht AD / PD (n = 10) an AD (n = 10) Fäll. ) Echantillon. Emery Goizueta ADRC. D'Demographie vun dësen 40 Fäll goufen virdru beschriwwen (25) a sinn an Table S1B zesummegefaasst. Mir hunn TMT-MS benotzt fir dës 40 Gehirgewebe an d'Replikatiounskohort vun 27 Fäll ze analyséieren. Am Ganzen hunn dës zwee Gehirdatensätz 227.121 eenzegaarteg Peptiden produzéiert, déi op 12.943 Proteome (25) kartéiert goufen. Nëmmen déi Proteinen, déi op d'mannst 50% vun de Fäll quantifizéiert goufen, goufen an de spéideren Ermëttlungen abegraff. De finalen Entdeckungsdatenset enthält 8817 quantifizéiert Proteinen. Ajustéieren Protein Iwwerfloss Niveauen baséiert op Alter, Geschlecht, a Post-mortem Intervall (PMI). D'Differenziell Ausdrock Analyse vun der Donnéeën Formatioun no Réckgang gewisen, datt> 2000 Protein Niveauen vill geännert goufen [P VerfÜgung & Si besteet; 0,05, Analyse vun Varianz (ANOVA)] an zwee oder méi Krankheet cohorts. Dunn, standing mir eng iwwerwaacht Stärekoup Analyse baséiert op der differentiell ausgedréckt Proteinen, a P VerfÜgung & Si besteet; 0.0001 zu AD /Kontroll an /oder AD /PD Vergläicher (Dorënner S2, A a B, Table S2C). Dës 165 héich verännert Proteinen weisen kloer Fäll mat AD Pathologie aus der Kontroll- a PD Proben aus, déi staark AD-spezifesch Verännerungen am ganze Proteom bestätegt.
Mir hunn dunn en Algorithmus genannt Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) benotzt fir Netzwierkanalyse op den entdeckten Gehirproteom auszeféieren, deen d'Datenset a Proteinmoduler mat ähnlechen Ausdrockmuster organiséiert (11-13). D'Analyse identifizéiert 44 Moduler (M) co-ausgedréckt Proteinen, zortéiert an nummeréiert vun de gréisste (M1, n = 1821 Proteinen) op déi klengst (M44, n = 34 Proteinen) (Dorënner 2A an Table S2D)). Wéi uewen ernimmt (13) Berechent de representativen Ausdrock Profil oder charakteristesche Protein vun all Modul, a korreléiert et mat der Krankheet Staat an AD Pathologie, dat ass, etabléiert d'Allianz vun Alzheimer d'Krankheet Registry (CERAD) a Braak Score (Dorënner 2B). Insgesamt waren 17 Moduler wesentlech mat der AD Neuropathologie (P <0.05) verbonnen. Vill vun dëse Krankheet-Zesummenhang Moduler sinn och räich an Zell Typ-spezifesch lues (Dorënner 2B). Wéi uewen ernimmt (13), Zell Typ Beräicherung gëtt duerch Analyse vum Modul Iwwerlappung an der Referenz Lëscht vun Zell Typ-spezifesch Genen bestëmmt. Dës Genen ginn ofgeleet vu publizéierten Donnéeën an isoléierten Mausneuronen, Endothelial- a Glialzellen. RNA Sequencing (RNA-seq) Experiment (29).
(A) Entdeckt d'WGCNA vum Gehirproteom. (B) Biweight Midkorrelatioun (BiCor) Analyse vum modulare Ënnerschrëftprotein (den éischte grousse Bestanddeel vum modulare Proteinausdrock) mat AD neuropathologesche Charakteristiken (uewen), dorënner CERAD (Aβ Plaque) a Braak (Tau Tangles) Scores. D'Intensitéite vu positiven (rout) an negativen (blo) Korrelatiounen ginn duerch eng zweefaarweg Hëtztkaart gewisen, an d'Asterisken weisen statistesch Bedeitung (P <0,05). Benotzt Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ënnen) fir d'Zelltypassociatioun vun all Proteinmodul ze bewäerten. D'Intensitéit vum roude Schatten weist de Grad vun der Zellartberäicherung un, an d'Asterisk weist statistesch Bedeitung (P <0,05). Benotzt d'BH-Methode fir de P-Wäert ofgeleet vum FET ze korrigéieren. (C) GO Analyse vun modulare Proteinen. Déi enk verbonne biologesch Prozesser gi fir all Modul oder verbonne Modulgrupp gewisen. oligo, oligodendrozyten.
Eng Rei vu fënnef enk verbonnen Astrocyten a Mikroglia-räiche Moduler (M30, M29, M18, M24, a M5) huet eng staark positiv Korrelatioun mat AD Neuropathologie gewisen (Dorënner 2B). Ontologie Analyse verbënnt dës Glial Moduler mat Zellwachstum, Prolifératioun an Immunitéit (Figure 2C an Table S2E). Zwee zousätzlech Glialmoduler, M8 a M22, sinn och staark upreguléiert an der Krankheet. M8 ass héich verbonne mam Maut-ähnlechen Rezeptorwee, eng Signaliséierungskaskade déi eng Schlësselroll an der gebierter Immunantwort spillt (30). Zur selwechter Zäit ass M22 enk mat der post-translationaler Ännerung verbonnen. M2, déi reich an Oligodendrozyten ass, weist eng staark positiv Korrelatioun mat AD Pathologie an eng ontologesch Verbindung mat Nukleosidsynthese an DNA Replikatioun, wat eng verstäerkte Zellproliferatioun bei Krankheeten beweist. Insgesamt ënnerstëtzen dës Erkenntnisser d'Héicht vu Glialmoduler, déi mir virdru am AD Netzwierkproteom observéiert hunn (13, 17). Et gëtt de Moment fonnt datt vill AD-verbonne Glialmoduler am Netz méi niddereg Ausdrockniveauen a Kontroll- a PD-Fäll weisen, wat hir Krankheetspezifizitéit ervirhiewen déi an der AD erhéicht gëtt (Figure S2C).
Nëmme véier Moduler an eisem Netzproteom (M1, M3, M10 a M32) si staark negativ mat der AD Pathologie (P <0,05) korreléiert (Dorënner 2, B an C). Béid M1 a M3 si räich un neuronen Marker. M1 ass héich verbonne mat synaptesche Signaler, während M3 enk mat der mitochondrialer Funktioun verbonnen ass. Et gëtt keng Beweiser fir Zell Typ Beräicherung fir M10 an M32. M32 reflektéiert d'Verbindung tëscht M3 an Zellmetabolismus, während M10 héich verbonne mat Zellwachstum a Mikrotubulefunktioun ass. Am Verglach mat AD, ginn all véier Moduler a Kontroll a PD erhéicht, wat hinnen Krankheetspezifesch AD Ännerungen gëtt (Figure S2C). Insgesamt ënnerstëtzen dës Resultater de reduzéierten Heefegkeet vun neuronräiche Moduler, déi mir virdru an der AD observéiert hunn (13, 17). Zesummegefaasst huet d'Netzwierkanalyse vum Gehirproteom, dee mir entdeckt hunn, AD-spezifesch verännert Moduler produzéiert konsequent mat eise fréiere Erkenntnisser.
AD ass charakteriséiert duerch eng fréi asymptomatesch Etapp (AsymAD), an där Individuen Amyloidakkumulatioun ouni klineschen kognitiven Réckgang weisen (5, 31). Dës asymptomatesch Etapp stellt eng kritesch Fënster fir fréi Detektioun an Interventioun duer. Mir hu virdru staark modulär Erhaalung vun AsymAD an AD Gehirnetzproteom iwwer onofhängeg Datesets bewisen (13, 17). Fir sécherzestellen datt d'Gehirnetz, déi mir am Moment entdeckt hunn, konsequent mat dëse fréiere Erkenntnisser ass, hu mir d'Erhaalung vu 44 Moduler an der replizéierter Dateset vu 27 DLPFC Organisatiounen analyséiert. Dës Organisatiounen enthalen Kontroll (n = 10), AsymAD (n = 8) An AD (n = 9) Fäll. Kontroll an AD Echantillon goufen an der Analyse vun eiser Entdeckung Gehir Kohort abegraff (Table S1B), iwwerdeems AsymAD Fäll eenzegaarteg waren nëmmen an der Replikatioun Kohort. Dës AsymAD Fäll koumen och vun der Emory Goizueta ADRC Gehirbank. Obwuel d'Erkenntnes an der Zäit vum Doud normal war, waren d'Amyloidniveauen abnormal héich (mengen CERAD, 2,8 ± 0,5) (Table S1B).
TMT-MS Analyse vun dësen 27 Gehirgewebe huet zu der Quantifizéierung vun 11,244 Proteome gefouert. Dës lescht Zuel enthält nëmmen déi Proteinen, déi an op d'mannst 50% vun de Proben quantifizéiert sinn. Dëse replizéierten Dateset enthält 8638 (98.0%) vun den 8817 Proteinen, déi an eiser Entdeckungs-Gehiranalyse festgestallt goufen, an huet bal 3000 wesentlech geännert Proteinen tëscht der Kontroll- an AD Kohorten (P <0.05, nom Tukey's gepaart t Test fir Varianzanalyse) ( Tabell S2F). Ënnert dësen differenziell ausgedréckte Proteinen huet 910 och bedeitend Niveauverännerungen tëscht AD a Gehirproteome Kontrollfäll gewisen (P <0.05, nom ANOVA Tukey gepaart T-Test). Et ass derwäert ze bemierken datt dës 910 Markéierer héich konsequent sinn an der Richtung vun der Verännerung tëscht Proteome (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Dorënner S3A). Ënnert de verstäerkte Proteinen sinn d'Proteine mat de konsequentste Verännerungen tëscht Datesets haaptsächlech Member vun de glialräiche M5 a M18 Moduler (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, a GFAP). Ënnert de reduzéierte Proteinen, déi mat de konsequentsten Ännerungen ware bal ausschliesslech Membere vum M1 Modul (NPTX2, VGF, an RPH3A) mat der Synapse verbonnen. Mir verifizéiert weider d'AD-verbonne Verännerunge vu Midkine (MDK), CD44, secreted frizzled-verbonne Protein 1 (SFRP1) a VGF duerch westlech Blotting (Dorënner S3B). Modul Konservéierungsanalyse huet gewisen datt ongeféier 80% vun de Proteinmoduler (34/44) am Gehirproteom wesentlech am Replikatiounsdatenset konservéiert goufen (z-Score> 1.96, FDR korrigéiert P <0.05) (Figure S3C). Véierzéng vun dëse Moduler goufen speziell tëscht den zwee proteomes reservéiert (z-Score> 10, FDR korrigéiert P <1.0 × 10-23). Insgesamt beliicht d'Entdeckung an d'Replikatioun vum héije Grad vu Konsistenz am differentiellen Ausdrock a modulärer Zesummesetzung tëscht dem Gehirproteom d'Reproduzibilitéit vun den Ännerungen an AD frontal Cortex Proteinen. Zousätzlech huet et och bestätegt datt AsymAD a méi fortgeschratt Krankheeten eng ganz ähnlech Gehirnetzstruktur hunn.
Eng méi detailléiert Analyse vum differentiellen Ausdrock am Gehirerplikatiounsdatenset beliicht de bedeitende Grad vun AsymAD Protein Ännerungen, dorënner insgesamt 151 wesentlech geännert Proteinen tëscht AsymAD an der Kontroll (P <0.05) (Figure S3D). Konsequent mat der Amyloidbelaaschtung ass APP am Gehir vun AsymAD an AD wesentlech eropgaang. MAPT ännert nëmme wesentlech an der AD, wat konsequent ass mat verstäerkten Niveauen vun Tangles a senger bekannter Korrelatioun mam kognitiven Réckgang (5, 7). Déi glialräich Moduler (M5 a M18) sinn héich an de verstäerkte Proteinen an AsymAD reflektéiert, während den neuron-relatéierten M1 Modul dee representativste vun de reduzéierte Proteinen an AsymAD ass. Vill vun dësen AsymAD Marker weisen gréisser Verännerunge bei symptomatesche Krankheeten. Ënnert dëse Marker ass SMOC1, e Glialprotein dat zu M18 gehéiert, wat mat Gehirtumoren an der Entwécklung vun Aen a Gliedmaart assoziéiert ass (32). MDK ass en heparinbindende Wuesstumsfaktor am Zesummenhang mam Zellwachstum an Angiogenese (33), en anere Member vum M18. Am Verglach mat der Kontrollgruppe ass AsymAD wesentlech eropgaang, gefollegt vun enger méi grousser Erhéijung vun der AD. Am Géigesaz, gouf de synaptesche Protein Neuropentraxin 2 (NPTX2) wesentlech am AsymAD Gehir reduzéiert. NPTX2 war virdru mat Neurodegeneratioun assoziéiert an huet eng unerkannt Roll bei der Vermëttlung vun excitatoreschen Synapsen (34). Insgesamt weisen dës Resultater eng Vielfalt vu verschiddene preklinesche Proteinverännerungen an der AD déi schéngen mat der Schwéierkraaft vun der Krankheet weiderzekommen.
Virausgesat datt mir eng bedeitend Tiefe vun der Proteinofdeckung an der Entdeckung vum Gehirproteom erreecht hunn, versichen mir seng Iwwerlappung mam Netzniveau AD Transkriptom méi voll ze verstoen. Dofir hu mir de Gehirproteom verglach, dee mir mam Modul entdeckt hunn, dee mir virdru generéiert hunn aus der Mikroarraymiessung vun 18,204 Genen an AD (n = 308) a Kontroll (n = 157) DLPFC Stoffer (13). iwwerlappt. Am Ganzen hu mir 20 verschidde RNA Moduler identifizéiert, vill vun deenen d'Beräicherung vu spezifesche Zellarten bewisen hunn, dorënner Neuronen, Oligodendrozyten, Astrocyten a Mikroglia (Dorënner 3A). Déi multiple Ännerungen vun dëse Moduler an AD ginn an der Figur 3B gewisen. Konsequent mat eiser viregter Protein-RNA Iwwerlappungsanalyse mat der méi déif unlabeled MS Proteom (ongeféier 3000 Proteinen) (13), déi meescht vun de 44 Moduler am Gehirproteomnetz, dee mir fonnt hunn, sinn am Transkriptomenetz Et gëtt keng bedeitend Iwwerlappung an. eis Entdeckung an Replikatioun vun der 34 Protein Moduler déi am Gehir proteome héich erhale sinn, nëmmen 14 (~ 40%) laanschtgaangen Fisher d'exakt Test (FET) bewisen eng statistesch bedeitendst Iwwerlappung mat der transcriptome ze hunn (Dorënner 3A). Kompatibel mat DNA Schued Reparatur (P-M25 a P-M19), Protein Iwwersetzung (P-M7 a P-M20), RNA Bindung / Splicing (P-M16 a P-M21) a Protein Zilsetzung (P-M13 a P- M23) iwwerlappt net mat Moduler am Transkriptom. Dofir, och wann e méi déif Proteome-Datenset an der aktueller Iwwerlappungsanalyse (13) benotzt gëtt, gëtt de gréissten Deel vum AD Netzproteom net op d'Transkriptomnetz gekaart.
(A) Hypergeometresch FET weist d'Beräicherung vun Zelltypspezifesche Markéierer am RNA Modul vum AD Transkriptom (uewen) an de Grad vun der Iwwerlappung tëscht den RNA (x-Achs) a Protein (Y-Achs) Moduler vum AD Gehir (ënnen). D'Intensitéit vum roude Schatten weist de Grad vun der Beräicherung vun Zelltypen an der ieweschter Panel an d'Intensitéit vun der Iwwerlappung vun de Moduler am ënneschten Panel un. Asterisken weisen statistesch Bedeitung (P <0,05). (B) De Grad vun der Korrelatioun tëscht de charakteristesche Genen vun all Transkriptommodul an AD Status. D'Moduler op der lénker Säit sinn am meeschte negativ mat AD (blo) korreléiert, an déi op der rietser sinn am meeschte positiv korreléiert mat AD (rout). De Log-transforméierte BH-korrigéierten P Wäert weist de Grad vun der statistescher Bedeitung vun all Korrelatioun un. (C) Bedeitend iwwerlappend Moduler mat gemeinsame Zelltyp Beräicherung. (D) Korrelatiounsanalyse vun der log2 falt Ännerung vum markéierte Protein (x-Achs) an RNA (Y-Achs) am iwwerlappende Modul. De Pearson Korrelatiounskoeffizient mam relevante P Wäert gëtt ugewisen. Mikro, Mikroglia; Himmelskierper, Astrocyten. CT, Kontroll.
Déi meescht iwwerlappend Protein- a RNS-Module deelen ähnlech Zellart-Beräicherungsprofile a konsequent AD Ännerungsrichtungen (Dorënner 3, B an C). An anere Wierder, de synapse-relatéierte M1 Modul vum Gehirproteom (PM1) ass op dräi neuronal-räich homolog RNA Moduler (R-M1, R-M9 a R-M16) kartéiert, déi an AD Béid gewisen hunn. e reduzéierten Niveau. Ähnlech iwwerlappt déi glialräich M5 a M18 Proteinmoduler mat RNA Moduler reich an Astrocyten a Mikroglialmarker (R-M3, R-M7, a R-M10) a si staark involvéiert an Krankheeten erhéijen. Dës gedeelt modular Features tëscht den zwee Datesets ënnerstëtzen weider d'Zelltypberäicherung a Krankheetsbezunnen Ännerungen déi mir am Gehirproteom observéiert hunn. Wéi och ëmmer, hu mir vill bedeitend Differenzen tëscht der RNS a Proteinniveauen vun eenzelne Markéierer an dëse gemeinsame Moduler observéiert. Korrelatiounsanalyse vum differentiellen Ausdrock vun der Proteomik an der Transkriptomik vun de Molekülle bannent dësen iwwerlappende Moduler (Dorënner 3D) beliicht dës Inkonsistenz. Zum Beispill, APP an e puer aner Glial Modul Proteinen (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, an SFRP1) weisen eng bedeitend Erhéijung vun der AD Proteome, awer et war bal keng Ännerung am AD Transkriptom. Dës Protein-spezifesch Verännerungen kënnen enk mat Amyloid Plaques (23, 35) verbonne sinn, wat d'Proteome als Quell vu pathologesche Verännerungen ervirhiewen, an dës Verännerungen kënnen net am Transkriptom reflektéiert ginn.
No onofhängeg Analyse vum Gehir an CSF Proteome, déi mir entdeckt hunn, hu mir eng ëmfaassend Analyse vun den zwee Datesätz gemaach fir AD CSF Biomarker ze identifizéieren am Zesummenhang mat der Pathophysiologie vum Gehirnetz. Mir mussen als éischt d'Iwwerlappung vun den zwee Proteome definéieren. Och wann et allgemeng ugeholl gëtt datt CSF neurochemesch Verännerungen am AD Gehir reflektéiert (4), ass de genaue Grad vun der Iwwerlappung tëscht dem AD Gehir an dem CSF Proteom onkloer. Andeems Dir d'Zuel vun de gemeinsame Genprodukter vergläicht, déi an eisen zwee Proteome festgestallt goufen, hu mir festgestallt datt bal 70% (n = 1936) vun de Proteinen, déi an der cerebrospinal Flëssegkeet identifizéiert goufen, och am Gehir quantifizéiert goufen (Figure 4A). Déi meescht vun dësen iwwerlappende Proteine (n = 1721) ginn op ee vun de 44 Co-Expressiounsmoduler aus dem Entdeckungsgehir Dateset gezeechent (Figur 4B). Wéi erwaart hunn déi sechs gréisste Gehirmoduler (M1 bis M6) de gréisste Betrag vun der CSF Iwwerlappung ausgestallt. Allerdéngs ginn et méi kleng Gehir Moduler (Zum Beispill, M15 an M29) datt eng onerwaart héich Ofschloss vun Iwwerlappung erreechen, méi grouss wéi e Gehir Modul zweemol seng Gréisst. Dëst motivéiert eis eng méi detailléiert, statistesch ugedriwwe Method ze adoptéieren fir d'Iwwerlappung tëscht dem Gehir an der Cerebrospinal Flëss ze berechnen.
(A a B) D'Proteine detektéiert am Entdeckungsgehir an CSF Datesets iwwerlappt. Déi meescht vun dësen iwwerlappende Proteine si mat engem vun de 44 Co-Expressiounsmoduler vum Gehirn Co-Expressiounsnetz verbonnen. (C) Entdeckt d'Iwwerlappung tëscht dem Cerebrospinal Fluid Proteome an dem Gehirnetzproteom. All Zeil vun der Hëtztkaart stellt eng separat Iwwerlappungsanalyse vun der hypergeometrescher FET duer. Déi iewescht Zeil weist d'Iwwerlappung (gro / schwaarz Schatten) tëscht dem Gehirmodul an dem ganze CSF-Proteom. Déi zweet Zeil weist datt d'Iwwerlappung tëscht Gehirmoduler a CSF Protein (rout am Schiet) wesentlech upreguléiert ass an der AD (P <0.05). Déi drëtt Zeil weist datt d'Iwwerlappung tëscht Gehirnmoduler an CSF Protein (blo Schiet) wesentlech down-reguléiert an AD (P <0.05). Benotzt d'BH-Methode fir de P-Wäert ofgeleet vum FET ze korrigéieren. (D) Klappmodul Panel baséiert op Zell Typ Associatioun an Zesummenhang GO Begrëffer. Dës Paneele enthalen insgesamt 271 Gehir-relatéierte Proteinen, déi sënnvoll differentiell Ausdrock am CSF Proteom hunn.
Mat Single-tailed FETs, hu mir d'Wichtegkeet vu Protein Iwwerlappung tëscht dem CSF Proteom an eenzel Gehirmoduler bewäert. D'Analyse huet opgedeckt datt insgesamt 14 Gehirmoduler am CSF Dateset statistesch bedeitend Iwwerlappungen hunn (FDR ugepasst P <0.05), an en zousätzleche Modul (M18), deem seng Iwwerlappung no bei Bedeitung ass (FDR ugepasst P = 0.06) (Figure 4C) , Top Zeil). Mir sinn och interesséiert Moduler déi staark mat differentiell ausgedréckt CSF Proteinen iwwerlappt. Dofir hu mir zwee zousätzlech FET Analysen applizéiert fir ze bestëmmen wéi eng vun (i) CSF Protein wesentlech an der AD erhéicht gouf an (ii) CSF Protein war wesentlech an der AD erofgaang (P <0.05, gepaart t Test AD / Kontroll) Gehirmodule mat sënnvollen Iwwerlappung tëscht hinnen. Wéi an der Mëtt an ënnen Zeile vun der Figur 4C gewisen, weisen dës zousätzlech Analysen datt 8 vun de 44 Gehirmoduler wesentlech iwwerlappt mam Protein addéiert an AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, a M38) . ), während nëmmen zwee Moduler (M6 a M15) eng sënnvoll Iwwerlappung mam reduzéierte Protein an AD CSF weisen. Wéi erwaart sinn all 10 Moduler an de 15 Moduler mat der héchster Iwwerlappung mam CSF-Proteom. Dofir huelen mir un datt dës 15 Moduler High-Yield Quelle vun AD Gehir-ofgeleet CSF Biomarker sinn.
Mir hunn dës 15 iwwerlappend Moduler a fënnef grouss Proteinplacke geklappt op Basis vun hirer Proximitéit am WGCNA Bamdiagramm an hirer Associatioun mat Zelltypen a Genontologie (Dorënner 4D). Déi éischt Panel enthält Moduler reich an Neuronmarker a Synapse-relatéierte Proteinen (M1 a M12). De synaptesche Panel enthält insgesamt 94 Proteinen, an d'Niveauen am CSF Proteom hu wesentlech geännert, sou datt et déi gréisste Quell vu Gehir-relatéierten CSF Marker ënner de fënnef Panelen ass. Déi zweet Grupp (M6 a M15) huet déi enk Verbindung mat Endothelzellmarker a vaskuläre Kierper bewisen, wéi "Wonnheilung" (M6) an "Reguléierung vun der humoraler Immunantwort" (M15). M15 ass och héich verbonne mam Lipoprotein Metabolismus, deen enk mam Endothelium verbonnen ass (36). De vaskuläre Panel enthält 34 CSF Marker am Zesummenhang mam Gehir. Déi drëtt Grupp enthält Moduler (M2 a M4) déi wesentlech mat Oligodendrozyte Marker a Zellproliferatioun verbonne sinn. Zum Beispill enthalen déi Top-Niveau Ontologie Begrëffer vu M2 "positiv Reguléierung vun DNA Replikatioun" an "Purin Biosynthese Prozess". Mëttlerweil enthalen déi vu M4 "Glialzelldifferenzéierung" an "Chromosom Segregatioun". D'Myelinatiounspanel enthält 49 CSF Marker am Zesummenhang mam Gehir.
Déi véiert Grupp enthält déi meescht Moduler (M30, M29, M18, M24 a M5), a bal all Moduler si wesentlech räich u Mikroglia an Astrocytmarker. Ähnlech wéi d'Myelinatiounspanel enthält de véierte Panel och Moduler (M30, M29 a M18), déi enk mat der Zellproliferatioun verbonne sinn. Déi aner Moduler an dëser Grupp sinn héich verbonne mat immunologesche Begrëffer, wéi "Immuneffektprozess" (M5) an "Immunreaktiounsreguléierung" (M24). D'Glial Immungrupp enthält 42 CSF Markéierer am Zesummenhang mam Gehir. Schlussendlech enthält déi lescht Panel 52 Gehir-relatéierte Markéierer op de véier Moduler (M44, M3, M33, an M38), déi all op de Kierper am Zesummenhang mat Energielagerung a Metabolismus sinn. De gréisste vun dëse Moduler (M3) ass enk mat Mitochondrien verbonnen an ass räich un neuron-spezifesch Marker. M38 ass ee vun de méi klenge Modul Memberen an dësem Metabolom an weist och moderéiert Neuron Spezifizitéit.
Insgesamt reflektéieren dës fënnef Panelen eng breet Palette vun Zelltypen a Funktiounen am AD Cortex, a enthalen kollektiv 271 Gehir-relatéiert CSF Marker (Table S2G). Fir d'Validitéit vun dësen MS Resultater ze evaluéieren, hu mir den Proximity Extension Assay (PEA) benotzt, eng orthogonal Antikörper-baséiert Technologie mat Multiplexing Fähigkeiten, héich Sensibilitéit a Spezifizitéit, an hunn d'Cerebrospinal Fluid Proben nei analyséiert, déi mir fonnt hunn Eng Ënnergrupp vun dësen 271 Biomarker. (n = 36). Dës 36 Ziler weisen d'Verännerung vun der AD Multiple vun PEA, déi enk mat eise MS-baséierten Erkenntnisser verbonnen ass (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), Wat d'Resultater vun eiser ëmfaassender MS Analyse staark verifizéiert huet (Figure S4) ).
Déi biologesch Themen, déi vun eise fënnef Gruppen ënnersträicht, vu synaptesche Signaliséierung bis Energiemetabolismus, sinn all mat der Pathogenese vun AD (1-3) verbonnen. Dofir sinn all 15 Moduler, déi dës Panelen enthalen, mat der AD Pathologie am Gehirproteom bezunn, dat mir entdeckt hunn (Figure 2B). Déi bemierkenswäertst ass déi héich positiv pathologesch Korrelatioun tëscht eise Glialmoduler an déi staark negativ pathologesch Korrelatioun tëscht eise gréisste neuronale Moduler (M1 a M3). Déi differentiell Ausdrocksanalyse vun eisem replizéierte Gehirproteom (Figure S3D) beliicht och M5 a M18-ofgeleet Glialproteine. Bei AsymAD a symptomatescher AD sinn déi meescht erhéicht Glialproteine a M1-verwandte Synapsen De Protein gëtt am meeschte reduzéiert. Dës Observatioune weisen datt d'271 Cerebrospinal Flëssegkeetsmarker, déi mir an de fënnef Gruppen identifizéiert hunn, mat Krankheetsprozesser am AD Cortex verbonne sinn, och déi, déi an de fréien asymptomatesche Stadien optrieden.
Fir d'Verännerungsrichtung vun de Panelproteinen am Gehir a Spinalflëss besser ze analyséieren, hu mir déi folgend fir jiddereng vun den 15 iwwerlappende Moduler gezeechent: (i) fonnt de Modul Heefegkeet Niveau am Gehirndatenset an (ii) de Modul Protein Den Ënnerscheed gëtt an der cerebrospinal Flëssegkeet ausgedréckt (Figure S5). Wéi virdru scho gesot, gëtt WGCNA benotzt fir de Modul Heefegkeet oder charakteristesche Proteinwäert am Gehir ze bestëmmen (13). D'Vulkankaart gëtt benotzt fir den differentiellen Ausdrock vu modulare Proteinen an der cerebrospinal Flëssegkeet (AD / Kontroll) ze beschreiwen. Dës Figuren weisen datt dräi vun de fënnef Panelen verschidden Ausdrock Trends am Gehir a Spinalflëssegkeet weisen. Déi zwee Moduler vun der Synapse Panel (M1 a M12) weisen eng Ofsenkung vum Iwwerflossniveau am AD Gehir, awer wesentlech iwwerlappt mat dem verstäerkten Protein an der AD CSF (Figure S5A). D'Neuron-relatéierte Moduler, déi de Metabolom enthalen (M3 a M38) hunn ähnlech Gehir- a cerebrospinal Flëssegkeet Ausdrockmuster inkonsistent gewisen (Figure S5E). De vaskuläre Panel huet och verschidden Ausdrock Trends gewisen, obwuel seng Moduler (M6 a M15) mëttelméisseg am AD Gehir erhéicht goufen an an der Krankheet CSF erofgaange sinn (Figure S5B). Déi verbleiwen zwee Paneele enthalen grouss Glialnetzwierker, deenen hir Proteine konsequent a béide Kompartimenter upreguléiert ginn (Figure S5, C an D).
Notéiert w.e.g. datt dës Trends net allgemeng sinn fir all Markéierer an dëse Panelen. Zum Beispill enthält de synaptesche Panel verschidde Proteine déi wesentlech am AD Gehir an CSF reduzéiert ginn (Figure S5A). Ënnert dësen downreguléierte Cerebrospinal Flëssegkeetsmarker sinn NPTX2 a VGF vu M1, a Chromogranin B vu M12. Wéi och ëmmer, trotz dësen Ausnahmen, sinn déi meescht vun eise synaptesche Marker an der AD Spinalflëssegkeet erhéicht. Insgesamt konnten dës Analysen statistesch bedeitend Trends am Gehir an zerebrospinal Flëssegkeetsniveauen an jiddereng vun eise fënnef Panelen z'ënnerscheeden. Dës Trends markéieren déi komplex an dacks ënnerschiddlech Relatioun tëscht Gehir an CSF Protein Ausdrock an AD.
Dunn hu mir High-Throughput MS Replikatiounsanalyse (CSF Replikatioun 1) benotzt fir eis 271 Set vu Biomarker op déi villverspriechend a reproduzéierbar Ziler ze schmuel (Dorënner 5A). CSF Kopie 1 enthält am Ganzen 96 Echantillon vun Emory Goizueta ADRC, dorënner Kontroll, AsymAD, an AD Kohort (Table S1A). Dës AD Fäll sinn duerch mëll kognitiv Réckgang charakteriséiert (mengen MoCA, 20,0 ± 3,8), an Ännerungen an AD Biomarker bestätegt an cerebrospinal Flëssegket (Table S1A). Am Géigesaz zu der CSF Analyse déi mir fonnt hunn, gëtt dës Replikatioun mat enger méi effizienter an héijer Duerchschnëtt "Single-shot" MS Method (ouni Off-Line Fraktionéierung) ausgeführt, dorënner e vereinfachte Probepräparatiounsprotokoll, deen d'Noutwennegkeet vun der Immunodepletioun vun eenzelne Proben eliminéiert. . Amplaz gëtt en eenzegen immun-deputéierten "Verbesserungskanal" benotzt fir d'Signal vu manner reichend Proteinen ze verstäerken (37). Och wann et d'total Proteomedeckung reduzéiert, reduzéiert dës Single-Shot-Methode d'Maschinnzäit wesentlech an erhéicht d'Zuel vun den TMT-labeléierte Proben déi liewensfäeg analyséiert kënne ginn (17, 38). Am Ganzen huet d'Analyse 6.487 Peptiden identifizéiert, déi an 96 Fäll op 1.183 Proteome kartéiert goufen. Wéi mat der CSF Analyse hu mir fonnt, nëmmen déi Proteinen, déi an op d'mannst 50% vun de Proben quantifizéiert goufen, goufen an de folgende Berechnungen abegraff, an d'Donnéeën goufen zréckgezunn fir d'Auswierkunge vum Alter a Geschlecht. Dëst huet zu der definitiver Quantifizéierung vu 792 Proteome gefouert, 95% vun deenen och an der CSF Dateset fonnt goufen.
(A) Brain-related CSF Protein Ziler verifizéiert an der éischter replizéiert CSF Kohort an an der Final Panel abegraff (n = 60). (B bis E) Panel Biomarkerniveauen (komposit Z-Scores) gemooss an de véier CSF Replikatiounskohorten. Paired T-Tester oder ANOVA mat Tukey's Post-Korrektur goufen benotzt fir d'statistesch Bedeitung vun den Ännerungen am Heefegkeet an all Replikatanalyse ze evaluéieren. CT, Kontroll.
Well mir besonnesch interesséiert sinn fir eis 271 Gehir-relatéiert CSF Ziler duerch ëmfaassend Analyse ze verifizéieren, wäerte mir weider Untersuchung vun dësem replizéierte Proteome op dës Marker limitéieren. Ënnert dësen 271 Proteinen, goufen 100 an CSF Replikatioun fonnt 1. Figur S6A weist d'differenziell Ausdrock vun dësen 100 iwwerlappend Markéierer tëscht der Kontroll an AD Replikatioun Echantillon. Synaptesch a Metabolit-Histone erhéijen am meeschten an der AD, wärend vaskulär Proteinen am meeschte bei der Krankheet erofgoen. Déi meescht vun den 100 iwwerlappende Markéierer (n = 70) behalen déiselwecht Richtung vun der Ännerung an den zwee Datesets (Dorënner S6B). Dës 70 validéiert Gehir-relatéiert CSF Marker (Table S2H) reflektéieren gréisstendeels déi virdru observéiert Panel Ausdrock Trends, dat heescht d'Downregulatioun vu vaskuläre Proteinen an d'Upregulatioun vun allen anere Panelen. Nëmmen 10 vun dësen 70 validéierte Proteinen hunn Ännerungen am AD Heefegkeet gewisen, déi dës Panel Trends widdersprécht. Fir e Panel ze generéieren deen am Beschten den allgemengen Trend vum Gehir a Cerebrospinal Flëssegkeet reflektéiert, hu mir dës 10 Proteinen aus der Interessi Panel ausgeschloss, déi mir endlech verifizéiert hunn (Figure 5A). Dofir enthält eise Panel schlussendlech insgesamt 60 Proteine verifizéiert an zwee onofhängege CSF AD Kohorten mat verschiddene Probepräparatioun a MS Plattform Analyse. D'z-Score Ausdrock Komplott vun dëse Finale Brieder an der CSF Kopie 1 Kontroll an AD Fäll bestätegt de Panel Trend observéiert an der CSF Kohort mir fonnt (Dorënner 5B).
Ënnert dësen 60 Proteine sinn et Moleküle bekannt fir mat AD verbonnen ze sinn, sou wéi Osteopontin (SPP1), wat e pro-inflammatoreschen Zytokin ass, dee mat AD a ville Studien assoziéiert gouf (39-41), a GAP43, E synaptescht Protein. dat ass kloer mat der Neurodegeneratioun verbonnen (42). Déi meescht voll verifizéiert Proteine si Markéierer am Zesummenhang mat aner neurodegenerative Krankheeten, sou wéi amyotrophesch Lateral Sklerose (ALS) verbonne Superoxid Dismutase 1 (SOD1) a Parkinson Krankheet verbonnen Desaccharase (PARK7). Mir hunn och verifizéiert datt vill aner Marker, sou wéi SMOC1 a Gehir-räich Membranbefestigung Signaliséierungsprotein 1 (BASP1), virdru Linken op Neurodegeneratioun limitéiert hunn. Et ass derwäert ze bemierken datt wéinst hirem nidderegen allgemengen Heefegkeet am CSF Proteom et schwéier ass dës High-Throughput Single-Shot Detektiounsmethod ze benotzen fir MAPT a bestëmmten aner AD-relatéiert Proteinen (zum Beispill NEFL an NRGN) zouverlässeg z'entdecken. ) (43, 44).
Mir hunn dann dës 60 Prioritéit Panel Markéierer an dräi zousätzlech Replikatanalysen iwwerpréift. An CSF Copy 2 hu mir eng eenzeg TMT-MS benotzt fir eng onofhängeg Kohort vun 297 Kontroll an AD Echantillon vun Emory Goizueta ADRC (17) ze analyséieren. CSF Replikatioun 3 enthält eng Reanalyse vu verfügbaren TMT-MS Daten aus 120 Kontroll- an AD Patienten aus Lausanne, Schwäiz (45). Mir hunn méi wéi zwee Drëttel vun de 60 Prioritéitsmarker an all Datesaz festgestallt. Och wann d'Schwäizer Etude verschidde MS Plattformen an TMT Quantifikatiounsmethoden benotzt huet (45, 46), hu mir eis Paneltrends staark an zwee widderholl Analysen reproduzéiert (Dorënner 5, C an D, an Tabelle S2, I, an J). Fir d'Krankheet Spezifizitéit vun eisem Grupp ze evaluéieren, hu mir TMT-MS benotzt de véierte Replikatiounsdatenset (CSF Replikatioun 4) ze analyséieren, déi net nëmmen Kontroll (n = 18) an AD (n = 17) Fäll abegraff, awer och PD ( n = 14)), ALS (n = 18) a frontotemporal Demenz (FTD) Echantillon (n = 11) (Table S1A). Mir quantifizéiert erfollegräich bal zwee Drëttel vun de Panelproteine an dëser Kohort (38 vun 60). Dës Resultater markéieren d'AD-spezifesch Ännerungen an alle fënnef Biomarker Panelen (Figure 5E an Table S2K). D'Erhéijung vun der Metabolitgrupp huet déi stäerkst AD Spezifizitéit gewisen, gefollegt vun der Myelinatioun a Glial Grupp. A mannerem Ausmooss weist FTD och eng Erhéijung tëscht dëse Panelen, wat ähnlech potenziell Netzwierkverännerungen reflektéiere kann (17). Am Géigesaz, hunn ALS a PD bal déiselwecht Myelinatioun, Glial a Metabolomprofile gewisen wéi d'Kontrollgrupp. Insgesamt, trotz Differenzen an der Probepräparatioun, der MS Plattform, an der TMT Quantifizéierungsmethoden, weisen dës widderholl Analysen datt eis Prioritéit Panelmarker héich konsequent AD-spezifesch Ännerungen a méi wéi 500 eenzegaartege CSF Proben hunn.
AD Neurodegeneratioun ass wäit e puer Joer virum Ufank vu kognitiven Symptomer unerkannt ginn, sou datt et en dréngende Bedierfnes fir Biomarker vun AsymAD ass (5, 31). Wéi och ëmmer, ëmmer méi Beweiser weisen datt d'Biologie vun AsymAD wäit vun homogen ass, an déi komplex Interaktioun vu Risiko a Widderstandsfäegkeet féiert zu groussen individuellen Differenzen an der spéiderer Krankheetprogressioun (47). Och wa se benotzt gi fir AsymAD Fäll z'identifizéieren, hunn d'Niveaue vu Kär CSF Biomarker (Aβ1-42, total tau a p-tau) net bewisen datt se fäeg sinn zouverlässeg virauszesoen wien zu Demenz weider geet (4, 7), wat méi beweist. néideg fir holistesch Biomarker-Tools op Basis vu multiple Aspekter vun der Gehirphysiologie ze enthalen fir de Risiko vun dëser Bevëlkerung präzis ze stratifiéieren. Dofir hu mir duerno eis AD-validéiert Biomarker Panel an der AsymAD Bevëlkerung vun der CSF Kopie 1 analyséiert. Dës 31 AsymAD Fäll hunn anormal Kär Biomarkerniveauen (Aβ1-42 /total tau ELISA Verhältnis, <5.5) a komplett Erkenntnis (mëttel MoCA, 27.1) ± 2,2) (Table S1A). Zousätzlech hunn all Individuen mat AsymAD e klineschen Demenz Score vun 0, wat beweist datt et kee Beweis vun engem Réckgang vun der deeglecher kognitiver oder funktioneller Leeschtung ass.
Mir hunn als éischt d'Niveaue vun de validéierte Panelen an all 96 CSF Replikate 1 analyséiert, dorënner d'AsymAD Kohort. Mir hu festgestallt datt verschidde Panelen an der AsymAD Grupp bedeitend AD-ähnlech Iwwerflossverännerungen haten, de vaskuläre Panel huet e Downward Trend an AsymAD gewisen, während all aner Panelen en Upward Trend weisen (Figure 6A). Dofir, weisen all Brieder eng héich bedeitendst Korrelatioun mat ELISA Aβ1-42 an total tau Niveauen (Dorënner 6B). Am Géigesaz ass d'Korrelatioun tëscht der Grupp an dem MoCA Score relativ schlecht. Ee vun de méi markant Erkenntnisser vun dësen Analysen ass déi grouss Gamme vu Panel Iwwerfloss an der AsymAD Kohort. Wéi an der Figur 6A gewisen, kräizt de Panelniveau vun der AsymAD Grupp normalerweis de Panelniveau vun der Kontrollgruppe an der AD Grupp, a weist relativ héich Variabilitéit. Fir dës Heterogenitéit vun AsymAD weider ze entdecken, hu mir Multidimensional Scaling (MDS) Analyse op 96 CSF Replikatioun 1 Fäll applizéiert. MDS Analyse erlaabt d'Ähnlechkeet tëscht Fäll ze visualiséieren op Basis vu bestëmmte Variablen am Datesaz. Fir dës Cluster Analyse benotze mir nëmmen déi validéiert Panelmarker déi eng statistesch bedeitend Ännerung hunn (P <0,05, AD /Kontroll) an der CSF Entdeckung a Replikatioun 1 Proteome (n = 29) (Table S2L) Niveau. Dës Analyse produzéiert kloer raimlech Clustering tëscht eiser Kontroll an AD Fäll (Dorënner 6C). Am Géigesaz, sinn e puer AsymAD Fäll kloer an der Kontrollgruppe clusteréiert, anerer sinn an AD Fäll lokaliséiert. Fir dës AsymAD Heterogenitéit weider ze entdecken, hu mir eis MDS Kaart benotzt fir zwou Gruppe vun dësen AsymAD Fäll ze definéieren. Déi éischt Grupp abegraff AsymAD Fäll méi no un der Kontroll geclustert (n = 19), während déi zweet Grupp duerch AsymAD Fäll mat engem Markerprofil méi no bei AD charakteriséiert gouf (n = 12).
(A) Den Ausdrockniveau (z-Score) vun der CSF Biomarker Grupp an all 96 Proben an der CSF Replikatioun 1 Kohort, dorënner AsymAD. Analyse vun der Varianz mat der Post-Korrektur vum Tukey gouf benotzt fir d'statistesch Bedeitung vun de Panel Iwwerfloss Ännerungen ze evaluéieren. (B) Korrelatiounsanalyse vum Panelprotein Iwwerflossniveau (z-Score) mat MoCA Score a Gesamt Tau Niveau an ELISA Aβ1-42 a CSF Kopie 1 Proben. De Pearson Korrelatiounskoeffizient mam relevante P Wäert gëtt ugewisen. (C) D'MDS vun 96 CSF Kopie 1 Fäll war baséiert op der Heefegkeet Niveauen vun 29 validéiert Panel Marker, déi wesentlech an der Entdeckung an CSF Kopie 1 Datesets geännert goufen [P <0.05 AD /Kontroll (CT)]. Dës Analyse gouf benotzt fir d'AsymAD Grupp a Kontroll (n = 19) an AD (n = 12) Ënnergruppen opzedeelen. (D) De Vulkanplot weist den differentiellen Ausdrock vun all CSF Replikatioun 1 Proteine mat log2 klappt Ännerung (x-Achs) relativ zum -log10 statistesche P Wäert tëscht den zwou AsymAD Ënnergruppen. D'Biomarker vum Panel si faarweg. (E) CSF Replikatioun 1 Iwwerflossniveau vun de Selektiounsgrupp Biomarker ginn differenziell tëscht AsymAD Ënnergruppen ausgedréckt. Tukey d'Post-ugepasst Analyse vun Varianz war benotzt statistesch Bedeitung ze bewäerten.
Mir iwwerpréift den Ënnerscheed Protein Ausdrock tëscht dëse Kontroll an AD-wëll AsymAD Fäll (Dorënner 6D an Table S2L). Déi resultéierend Vulkankaart weist datt 14 Panelmarker bedeitend tëscht den zwou Gruppen geännert hunn. Déi meescht vun dëse Marker si Membere vun der Synapse a Metabolom. Wéi och ëmmer, SOD1 a myristoyléiert Alanin-räich Proteinkinase C Substrat (MARCKS), déi Member vun der Myelin- a Glialimmungruppen sinn, respektiv, gehéieren och zu dëser Grupp (Dorënner 6, D an E). De vaskuläre Panel huet och zwee Marker bäigedroen, déi wesentlech reduzéiert goufen an der AD-ähnlecher AsymAD Grupp, dorënner AE bindend Protein 1 (AEBP1) an ergänzen Familljemember C9. Et war kee groussen Ënnerscheed tëscht der Kontroll an AD-ähnlechen AsymAD Ënnergruppen an ELISA AB1-42 (P = 0.38) a p-tau (P = 0.28), awer et war tatsächlech e wesentlechen Ënnerscheed am Gesamt Tau Niveau (P = 0.0031) ) (Fig. S7). Et gi verschidde Panelmarker déi uginn datt d'Verännerungen tëscht den zwou AsymAD Ënnergruppen méi bedeitend sinn wéi déi total tau Niveauen (zum Beispill YWHAZ, SOD1, an MDH1) (Figure 6E). Insgesamt weisen dës Resultater datt eis validéiert Panel Biomarker enthalen kann, déi a potenziell Risikostratifikatioun vu Patienten mat asymptomatescher Krankheet subtype kënnen.
Et gëtt en dréngende Bedierfnes fir systembaséiert Biomarker-Tools fir déi verschidde Pathophysiologie hannert AD besser ze moossen an ze zielen. Dës Tools ginn erwaart net nëmmen eisen AD diagnostesche Kader z'änneren, awer och d'Adoptioun vun effektiven, patientspezifesche Behandlungsstrategien förderen (1, 2). Zu dësem Zweck hu mir eng onparteiesch ëmfaassend Proteomik Approche fir AD Gehir an CSF applizéiert fir Web-baséiert CSF Biomarker z'identifizéieren déi eng breet Palette vu Gehir-baséierter Pathophysiologie reflektéieren. Eis Analyse produzéiert fënnef CSF Biomarker Panelen, déi (i) Synapsen, Bluttgefässer, Myelin, Immun a metabolesch Dysfunktioun reflektéieren; (ii) staark reproducibility op verschiddene MS Plattformen weisen; (iii) Show progressiv Krankheet-spezifesch Verännerungen duerch déi fréi a spéide Stadien vun der AD. Insgesamt representéieren dës Erkenntnisser e verspriechende Schrëtt a Richtung Entwécklung vu verschiddenen, zouverléissege, weborientéierte Biomarker-Tools fir AD Fuerschung a klinesch Uwendungen.
Eis Resultater weisen déi héich konservéiert Organisatioun vum AD Gehirnetzproteom an ënnerstëtzen hir Notzung als Anker fir systembaséiert Biomarker Entwécklung. Eis Analyse weist datt zwee onofhängeg TMT-MS Datesätz mat AD an AsymAD Gehirer staark Modularitéit hunn. Dës Erkenntnisser verlängeren eis viregt Aarbecht, déi d'Erhaalung vun de mächtege Moduler vu méi wéi 2,000 Gehirgewebe vu multiple onofhängege Kohorten an der frontal, parietal an temporärer Cortex demonstréieren (17). Dëst Konsensnetz reflektéiert verschidde Krankheetsbezunnen Ännerungen, déi an der aktueller Fuerschung observéiert ginn, dorënner d'Erhéijung vun glialräichen entzündleche Moduler an d'Ofsenkung vun neuronräiche Moduler. Wéi déi aktuell Fuerschung, huet dëst grousst Netzwierk och bedeitend modulär Verännerungen am AsymAD, wat eng Vielfalt vu verschiddene preklineschen Pathophysiologie weist (17).
Wéi och ëmmer, an dësem héich konservativen systembaséierte Kader gëtt et méi feinkorneg biologesch Heterogenitéit, besonnesch ënner Individuen an de fréie Stadien vun der AD. Eis Biomarker Panel ass fäeg zwou Ënnergruppen an AsymAD ze weisen, déi de bedeitende differentiellen Ausdrock vu multiple CSF Marker weisen. Eis Grupp konnt d'biologesch Differenzen tëscht dësen zwou Ënnergruppen ervirhiewen, déi net offensichtlech waren um Niveau vun de Kär AD Biomarker. Am Verglach mat der Kontrollgruppe waren d'Aβ1-42 /total Tau Verhältnisser vun dësen AsymAD Individuen anormal niddereg. Wéi och ëmmer, nëmmen déi total Tau Niveauen waren wesentlech anescht tëscht den zwou AsymAD Ënnergruppen, während d'Aβ1-42 a p-tau Niveauen relativ vergläichbar bliwwen sinn. Zënter héich CSF Tau schéngt e bessere Prädiktor vu kognitiven Symptomer ze sinn wéi Aβ1-42 Niveauen (7), mir de Verdacht datt déi zwee AsymAD Kohorten verschidde Risike vu Krankheetprogressioun hunn. Wéinst der limitéierter Probegréisst vun eisem AsymAD an dem Mangel u Längsdaten, ass weider Fuerschung gebraucht fir dës Conclusiounen zouversiichtlech ze zéien. Wéi och ëmmer, dës Resultater weisen datt e systembaséiert CSF Panel eis Fäegkeet verbessert fir effektiv Individuen während der asymptomatescher Etapp vun der Krankheet ze stratifizéiert.
Allgemeng ënnerstëtzen eis Erkenntnisser d'Roll vu multiple biologesche Funktiounen an der Pathogenese vun AD. Wéi och ëmmer, dysreguléierten Energiemetabolismus gouf dat prominent Thema vun all eise fënnef validéierte Labelplacke. Metabolesch Proteinen, wéi Hypoxanthin-Guanin Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) a Laktatdehydrogenase A (LDHA), sinn déi robust validéiert synaptesch Biomarker, wat beweist datt d'Erhéijung vun der AD CSF héich reproduzéierbar Geschlecht ass. Eis Bluttgefässer a Glialplacke enthalen och verschidde Marker, déi am Metabolismus vun oxidativen Substanzen involvéiert sinn. Dës Erkenntnisser sinn konsequent mat der Schlësselroll déi metabolesch Prozesser am ganze Gehir spillen, net nëmmen fir d'héich Energiebedarf vun Neuronen z'erreechen, awer och fir d'héich Energiefuerderung vun Astrocyten an aner Glialzellen z'erreechen (17, 48). Eis Resultater ënnerstëtzen wuessend Beweiser datt Ännerungen am Redoxpotenzial an Ënnerbriechung vun Energieweeër de Kärverbindung tëscht verschiddene Schlësselprozesser involvéiert sinn an der Pathogenese vun AD, inklusiv mitochondriale Stéierungen, glial-mediéiert Entzündung a vaskuläre Schued (49). Zousätzlech enthalen déi metabolesch cerebrospinal Flëssegkeet Biomarker eng grouss Zuel vun ënnerschiddlech reichen Proteinen tëscht eiser Kontroll an AD-ähnlechen AsymAD Ënnergruppen, wat suggeréiert datt d'Stéierung vun dësen Energie- a Redoxweeër kritesch an der preklinescher Etapp vun der Krankheet ka sinn.
Déi verschidde Gehir- a Cerebrospinal Flësseg Panel Trends déi mir observéiert hunn hunn och interessant biologesch Implikatiounen. Synapsen a Metabolome reich an Neuronen weisen ofgeholl Niveauen am AD Gehir a verstäerkter Heefegkeet an zerebrospinal Flëssegkeet. Gitt datt Neuronen reich an energieproduzéierende Mitochondrien bei Synapsen sinn fir Energie fir hir vill spezialiséiert Signaler ze liwweren (50), gëtt d'Ähnlechkeet vun den Ausdrockprofile vun dësen zwou Neurongruppen erwaart. De Verloscht vun Neuronen an d'Extrusioun vu beschiedegten Zellen kënnen dës Gehir- a CSF Panel Trends a spéider Krankheet erklären, awer si kënnen déi fréi Panel Ännerungen net erklären, déi mir observéieren (13). Eng méiglech Erklärung fir dës Erkenntnisser bei fréi asymptomatescher Krankheet ass anormal synaptesch Pruning. Nei Beweiser a Mausmodeller suggeréieren datt mikroglia-mediéiert synaptesch Phagozytose anormal an AD aktivéiert ka ginn an zu fréie Synapse Verloscht am Gehir féieren (51). Dëst verworf synaptescht Material kann an CSF accumuléieren, dofir beobachten mir d'Erhéijung vun der CSF an der Neuronpanel. Immun-mediéiert synaptesch Pruning kann och deelweis d'Erhéijung vun de Glialproteine erklären, déi mir am Gehir a cerebrospinal Flëss am ganze Krankheetsprozess observéieren. Zousätzlech zu synaptesche Pruning kënnen allgemeng Abnormalitéiten am exozytesche Wee och zu verschiddene Gehirn- a CSF Ausdrock vun neuronalen Marker féieren. Eng Rei Studien hu gewisen datt den Inhalt vun Exosomen an der Pathogenese vum AD Gehir geännert huet (52). Den extrazelluläre Wee ass och an der Verbreedung vun Aβ involvéiert (53, 54). Et ass derwäert ze bemierken datt d'Ënnerdréckung vun der exosomaler Sekretioun AD-ähnlech Pathologie an AD transgene Mausmodeller reduzéiere kann (55).
Zur selwechter Zäit huet de Protein am vaskuläre Panel eng moderéiert Erhéijung vum AD Gehir gewisen, awer wesentlech an der CSF ofgeholl. D'Blutt-Gehir Barrière (BBB) Dysfunktioun kann dës Erkenntnisser deelweis erklären. Vill onofhängeg postmortem mënschlech Studien hunn BBB Decompte bei AD (56, 57) bewisen. Dës Studien bestätegt verschidde anormal Aktivitéiten ronderëm dës enk versiegelt Schicht vun Endothelzellen, dorënner Gehirkapillär Leckage a perivaskulär Akkumulation vu Bluttgedroen Proteinen (57). Dëst kann eng einfach Erklärung fir déi erhéicht vaskulär Proteinen am Gehir ubidden, awer et kann d'Ausarmung vun deene selwechte Proteinen an der cerebrospinaler Flëssegkeet net komplett erklären. Eng Méiglechkeet ass datt den Zentralnervensystem dës Moleküle aktiv isoléiert fir de Problem vun enger verstäerkter Entzündung an der oxidativer Stress ze léisen. D'Reduktioun vun e puer vun de schwéiersten CSF Proteinen an dësem Panel, besonnesch déi, déi an der Lipoproteinregulatioun involvéiert sinn, ass mat der Inhibitioun vu schiedlechen Niveauen vun der Entzündung an dem neuroprotective Prozess vun reaktive Sauerstoffaarten verbonnen. Dëst ass wouer fir Paroxonase 1 (PON1), e Lipoprotein bindend Enzym verantwortlech fir d'Oxidativ Stressniveauen an der Zirkulatioun ze reduzéieren (58, 59). Alpha-1-Mikroglobulin / Bikunin Virgänger (AMBP) ass en anere wesentlech down-reguléierte Marker vun der vaskulärer Grupp. Et ass de Virgänger vum Lipidtransporter Bikunin, deen och an der Entzündungsënnerdréckung an dem neurologesche Schutz involvéiert ass (60, 61).
Trotz verschiddenen interessanten Hypothesen ass d'Onméiglechkeet fir direkt biochemesch Krankheetsmechanismen z'entdecken ass eng bekannte Begrenzung vun der Entdeckungsgedriwwener Proteomik Analyse. Dofir ass weider Fuerschung noutwendeg fir d'Mechanismen hannert dëse Biomarker Panelen zouversiichtlech ze definéieren. Fir op d'Entwécklung vun der MS-baséierter klinescher Analyse ze bewegen, erfuerdert déi zukünfteg Richtung och d'Benotzung vu geziilte quantitative Methoden fir grouss Biomarkerverifizéierung, sou wéi selektiv oder parallel Reaktiounsiwwerwaachung (62). Mir hunn viru kuerzem parallel Reaktiounsiwwerwaachung (63) benotzt fir vill vun den CSF Protein Ännerungen ze validéieren déi hei beschriwwe ginn. Verschidde Prioritéit Panel Ziler gi mat bedeitende Genauegkeet quantifizéiert, dorënner YWHAZ, ALDOA, a SMOC1, déi op eis Synapse, Metabolismus an Entzündungspanele kartéieren, respektiv (63). Onofhängeg Data Acquisition (DIA) an aner MS-baséiert Strategien kënnen och nëtzlech sinn fir Zilverifizéierung. Budd et al. (64) Et gouf viru kuerzem bewisen datt et e wesentlechen Iwwerlappung tëscht den AD Biomarker identifizéiert an eisem CSF Entdeckungsdatenset an dem onofhängege DIA-MS Dateset, deen aus bal 200 CSF Proben aus dräi verschiddenen europäesche Kohorten besteet. Dës rezent Studien ënnerstëtzen d'Potenzial vun eise Paneele fir an zouverlässeg MS-baséiert Detektioun ze transforméieren. Traditionell Antikörper an Aptamer-baséiert Detektioun ass och wichteg fir d'Weiderentwécklung vu Schlëssel AD Biomarker. Wéinst dem nidderegen Heefegkeet vu CSF ass et méi schwéier dës Biomarker z'entdecken mat High-Throughput MS Methoden. NEFL an NRGN sinn zwee sou Beispiller vu niddereg-Heefegkeet CSF Biomarker, déi op de Panel an eiser ëmfaassender Analyse gekaart ginn, awer net zouverlässeg erkannt kënne ginn mat eiser eenzeger MS Strategie. Zilstrategien baséiert op multiple Antikörper, wéi PEA, kënnen d'klinesch Transformatioun vun dëse Marker förderen.
Insgesamt bitt dës Studie eng eenzegaarteg Proteomik Approche fir d'Identifikatioun an d'Verifizéierung vun CSF AD Biomarker baséiert op verschiddene Systemer. D'Optimisatioun vun dëse Markerpanelen iwwer zousätzlech AD Kohorten a MS Plattformen kann verspriechend beweisen fir AD Risikostratifikatioun a Behandlung ze förderen. Studien, déi de Längsniveau vun dëse Paneele mat der Zäit evaluéieren, sinn och kritesch fir ze bestëmmen, wéi eng Kombinatioun vu Markéierer am Beschten de Risiko vu fréie Krankheeten a Verännerungen an der Schwieregkeet vun der Krankheet stratifizéiert.
Ausser fir d'3 Echantillon vun CSF kopéiert, all CSF Echantillon an dëser Etude benotzt goufen ënner der Astellung vun Emory ADRC oder enk Zesummenhang Fuerschung Institutiounen gesammelt. Insgesamt véier Sätze vun Emory CSF Echantillon goufen an dëse proteomics Studien benotzt. D'CSF Kohort gouf fonnt fir Proben aus 20 gesonde Kontrollen an 20 AD Patienten ze enthalen. CSF Kopie 1 enthält Proben aus 32 gesonde Kontrollen, 31 AsymAD Individuen, an 33 AD Individuen. CSF Kopie 2 enthält 147 Kontrollen an 150 AD Echantillon. D'Multi-Krankheet CSF Replikatioun 4 Kohort abegraff 18 Kontrollen, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, an 11 FTD Echantillon. Geméiss dem Accord guttgeheescht vum Emory University Institutional Review Board, hunn all Emory Studie Participanten informéiert Zoustëmmung kritt. Geméiss dem 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), gouf cerebrospinal Flëssegkeet gesammelt a gespäichert duerch Lendegerpunkt. Kontroll an AsymAD an AD Patienten kruten standardiséierte kognitiv Bewäertung an der Emory Cognitive Neurology Clinic oder Goizueta ADRC. Hir cerebrospinal Flëssegket Echantillon waren vun INNO-BIA AlzBio3 Luminex getest fir ELISA Aβ1-42, total tau an p-tau Analyse (65). ELISA Wäerter gi benotzt fir d'diagnostesch Klassifikatioun vun Themen z'ënnerstëtzen baséiert op etabléierten AD Biomarker Ofschnëttskriterien (66, 67). Basis demographesch an diagnostesch Donnéeën fir aner CSF Diagnosen (FTD, ALS a PD) ginn och vun Emory ADRC oder verbonne Fuerschungsinstituter kritt. De Resumé Fall Metadaten fir dës Emory CSF Fäll kënnen an Table S1A fonnt ginn. D'Charakteristike vun der Schwäizer CSF Replikatioun 3 Kohort goufen virdru publizéiert (45).
CSF huet d'Probe fonnt. Fir d'Tiefe vun eiser Entdeckung vum CSF Dateset ze erhéijen, gouf den Immunkonsum vu Proteinen mat héijer Heefegkeet virum Trypsiniséierung gemaach. Kuerz gesot, 130 μl CSF aus 40 individuellen CSF Proben an e gläiche Volumen (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) goufen an enger Spin Kolonn (Thermo Fisher Scientific, A89868) am Raum gesat. Temperatur inkubéieren). No 15 Minutte Spinn, centrifugéiert d'Probe bei 1000g fir 2 Minutten. En 3K ultracentrifugal Filterapparat (Millipore, UFC500396) gouf benotzt fir d'Effluentprobe ze konzentréieren andeems se bei 14.000g fir 30 Minutten centrifugéieren. Verdünnt all Probevolumen op 75 μl mat phosphatgebufferter Salzlinn. D'Protein Konzentratioun gouf vun der bicinchoninic Seier (BCA) Method no dem Fabrikant d'Protokoll (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) bewäert. D'immunodepleted CSF (60 μl) vun all 40 Echantillon war mat lysyl endopeptidase (LysC) an trypsin verdaut. Kuerz gesot, d'Probe gouf reduzéiert an alkyléiert mat 1,2 μl 0,5 M Tris-2 (-Carboxyethyl)-Phosphin an 3 μl 0,8 M Chloroacetamid bei 90 ° C fir 10 Minutten, an duerno an engem Waasserbad fir 15 Minutten sonicated. D'Probe gouf mat 193 μl 8 M Harnstoffbuffer verdënntem [8 M Harnstoff an 100 mm NaHPO4 (pH 8,5)] zu enger Finale Konzentratioun vu 6 M Harnstoff. LysC (4,5 μg; Wako) gëtt fir Iwwernuechtung Verdauung bei Raumtemperatur benotzt. D'Probe gouf dann op 1 M Harnstoff mat 50 mM Ammoniumbikarbonat (ABC) (68) verdünnt. Füügt e gläiche Betrag (4,5 μg) Trypsin (Promega) derbäi, an inkubéiert dann d'Probe fir 12 Stonnen. Acidéieren déi verdaut Peptid Léisung zu enger Finale Konzentratioun vun 1% Mieresäure (FA) an 0,1% Trifluoroacetic Seier (TFA) (66), an dann desalting mat enger 50 mg Sep-Pak C18 Kolonn (Waasser) wéi uewen beschriwwen (25) . De Peptid gouf dann an 1 ml 50% Acetonitril (ACN) eluéiert. Fir d'Proteinquantifikatioun iwwer Chargen (25) ze standardiséieren, goufen 100 μl Aliquots vun all 40 CSF Proben kombinéiert fir eng gemëschte Probe ze generéieren, déi duerno a fënnef global intern Standard (GIS) (48) Proben opgedeelt gouf. All eenzel Echantillon a kombinéiert Standarden sinn duerch Héich-Vitesse Vakuum gedréchent (Labconco).
CSF kopéiert d'Probe. Dayon a Kollegen hu virdru d'Immunverschmotzung an d'Verdauung vun der CSF Kopie 3 Proben beschriwwen (45, 46). Déi reschtlech replizéiert Echantillon waren net individuell immunodepleted. Verdauen dës net entfernte Proben am Trypsin wéi virdru beschriwwen (17). Fir all widderholl Analyse, goufen 120 μl aliquots vun der elued peptide aus all Prouf zesummegefaasst an an gläiche Volumen aliquots opgedeelt fir als TMT-labeléiert global intern Standard (48) ze benotzen. All eenzel Echantillon a kombinéiert Standarden sinn duerch Héich-Vitesse Vakuum gedréchent (Labconco). Fir d'Signal vum niddereg-Heefegkeet CSF Protein ze verbesseren, andeems 125 μl vun all Probe kombinéiert gouf, gouf eng "verstäerkt" Probe fir all Replikatanalyse virbereet [dh eng biologesch Probe déi d'Fuerschungsprobe miméiert, awer de verfügbare Betrag ass vill méi grouss (37, 69)] fusionéiert an eng gemëscht CSF Prouf (17). D'gemëschte Probe gouf dann mat 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) immunoremoved benotzt, verdaut wéi uewen beschriwwen, an an der folgender Multiple TMT Etikett abegraff.
Post Zäit: Aug-27-2021